Secuenciación de proteínas, La determinación de la composición de aminoácidos, Análisis de aminoácidos N-terminal, El análisis de aminoácidos C-terminal, La degradación de Edman, La reacción de degradación de Edman, La espectrometría de masas, Predicción de la secuencia de la proteína a partir de secuencias de ADN/ARN



Secuenciación de proteínas es una técnica para determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína, así como la conformación que adopta la proteína y el grado en que se forma un complejo con cualquier moléculas no peptídicas. El descubrimiento de las estructuras y funciones de las proteínas en los seres vivos es una herramienta importante para la comprensión de los procesos celulares, y permite que los fármacos que se dirigen a las vías metabólicas específicas que se inventaron más fácilmente.

Los dos principales métodos directos de secuenciación de proteínas son la espectrometría de masas y la reacción de degradación de Edman. También es posible generar una secuencia de aminoácidos de la secuencia de ADN o ARNm que codifica la proteína, si se conoce. Sin embargo, hay un número de otras reacciones que se pueden usar para obtener más información limitada acerca de las secuencias de proteínas y se puede utilizar como preliminares a los métodos antes mencionados de la secuenciación o para corregir las deficiencias específicas dentro de ellos.

La determinación de la composición de aminoácidos

A menudo es deseable conocer la composición de aminoácidos de una proteína no ordenada antes de tratar de encontrar la secuencia ordenada, ya que este conocimiento puede ser usado para facilitar el descubrimiento de errores en el proceso de secuenciación o para distinguir entre resultados ambiguos. El conocimiento de la frecuencia de ciertos aminoácidos también se puede usar para elegir qué proteasa a utilizar para la digestión de la proteína. Un método generalizado a menudo referido como análisis de aminoácidos para determinar la frecuencia de aminoácidos es la siguiente:

  • Hidrolizar una cantidad conocida de la proteína en sus aminoácidos constituyentes.
  • Separar y cuantificar los aminoácidos en alguna forma.
  • Hidrólisis

    La hidrólisis se lleva a cabo por calentamiento de una muestra de la proteína en ácido clorhídrico 6 M a 100-110C durante 24 horas o más. Las proteínas con muchos grupos hidrófobos voluminosos pueden requerir períodos de calentamiento más largos. Sin embargo, estas condiciones son tan vigoroso que algunos aminoácidos son degradados. Para eludir este problema, Bioquímica en línea sugiere calentar muestras separadas para diferentes momentos, el análisis de cada solución resultante, y la extrapolación de nuevo a tiempo de hidrólisis cero. Rastall sugiere una variedad de reactivos para prevenir o reducir la degradación, tales como reactivos de tiol o fenol para proteger el triptófano y la tirosina a partir de ataque por el cloro, y la cisteína de pre-oxidante. También sugiere la medición de la cantidad de amoniaco evolucionado para determinar el grado de hidrólisis de la amida.

    Separación

    Los aminoácidos pueden ser separados por cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrófoba. Un ejemplo de lo anterior se da por la NTRC usando poliestireno sulfonado como una matriz, la adición de los aminoácidos en una solución de ácido y pasar un tampón de pH cada vez mayor a través de la columna. Los aminoácidos se pueden eluir cuando el pH llega a sus respectivos puntos isoeléctricos. La última técnica se puede emplear mediante el uso de cromatografía de fase inversa. Muchos C8 disponibles comercialmente y columnas de sílice C18 han demostrado separación exitosa de los aminoácidos en solución en menos de 40 minutos a través de la utilización de un gradiente de elución optimizado.

    Análisis cuantitativo

    Una vez que los aminoácidos han sido separados, sus respectivas cantidades se determinan mediante la adición de un reactivo que formará un derivado coloreado. Si las cantidades de los aminoácidos están en exceso de 10 nmol, ninhidrina se puede utilizar para este - que da un color amarillo cuando se hace reaccionar con prolina, y una púrpura viva con otros aminoácidos. La concentración de aminoácidos es proporcional a la absorbancia de la solución resultante. Con muy pequeñas cantidades, hasta 10 pmol, fluorescamina se puede utilizar como un marcador: esto forma un derivado fluorescente de reaccionar con un aminoácido.

    Análisis de aminoácidos N-terminal

    La determinación de qué forma el aminoácido N-terminal de una cadena peptídica es útil por dos razones: para ayudar a la ordenación de las secuencias de fragmentos de péptidos individuales en una cadena entera, y porque la primera ronda de la degradación de Edman a menudo está contaminada por impurezas y por lo tanto hace no dar una determinación exacta del aminoácido N-terminal. Un método generalizado para el análisis de aminoácidos N-terminal sigue:

  • Se hizo reaccionar el péptido con un reactivo que va a etiquetar selectivamente el aminoácido terminal.
  • Hidrolizar la proteína.
  • Determinar el aminoácido mediante cromatografía y la comparación con estándares.
  • Hay muchos reactivos diferentes que se pueden utilizar para etiquetar los aminoácidos terminales. Todos ellos reaccionan con los grupos amina y serán por lo tanto, también se unen a los grupos amina en las cadenas laterales de aminoácidos tales como lisina - por esta razón es necesario tener cuidado en la interpretación de los cromatogramas para asegurarse de que el sitio correcto se elige. Dos de los reactivos más comunes son el reactivo de Sanger y derivados de dansilo, tales como cloruro de dansilo. Isotiocianato de fenilo, el reactivo para la degradación de Edman, puede también ser utilizado. Las mismas preguntas se aplican aquí como en la determinación de la composición de aminoácidos, con la excepción de que se necesita ninguna mancha, como los reactivos producen derivados de colores y sólo se requiere el análisis cualitativo, por lo que el aminoácido no tiene que ser eluida de la columna de la cromatografía , sólo en comparación con un estándar. Otra consideración a tener en cuenta es que, puesto que ningún grupo amina se han reaccionado con el reactivo de marcaje, cromatografía de intercambio iónico no se puede utilizar, y cromatografía en capa fina o cromatografía líquida de alta presión se debe utilizar en su lugar.

    El análisis de aminoácidos C-terminal

    El número de métodos disponibles para el análisis de aminoácidos C-terminal es mucho menor que el número de métodos disponibles de análisis N-terminal. El método más común es añadir carboxipeptidasas a una solución de la proteína, tomar muestras a intervalos regulares, y determinar el aminoácido terminal mediante el análisis de una parcela de las concentraciones de aminoácidos en función del tiempo.

    La degradación de Edman

    La degradación de Edman es una reacción muy importante para la secuenciación de la proteína, ya que permite a la composición de aminoácidos ordenada de una proteína que se descubrió. Edman secuenciadores automatizados son ahora de uso generalizado, y son capaces de secuencia de péptidos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Un esquema de reacción para la secuenciación de una proteína por la degradación de Edman sigue - algunos de los pasos que se elaboran en posteriormente.

  • Romper cualquier puente disulfuro en la proteína con un agente reductor como el 2-mercaptoetanol. Un grupo protector tal como ácido yodoacético puede ser necesario para evitar que los bonos se vuelva a formar.
  • Separar y purificar las cadenas individuales del complejo de la proteína, si hay más de uno.
  • Determinar la composición de aminoácidos de cada cadena.
  • Determinar los aminoácidos terminales de cada cadena.
  • Romper cada cadena en fragmentos menores de 50 aminoácidos de longitud.
  • Separar y purificar los fragmentos.
  • Determinar la secuencia de cada fragmento.
  • Repita el procedimiento con un patrón diferente de la escisión.
  • Construir la secuencia de la proteína total.
  • Digestión en fragmentos de péptidos Los péptidos más largos de aproximadamente 50-70 aminoácidos de longitud no puede ser secuenciado forma fiable por la degradación de Edman. Debido a esto, las largas cadenas de proteínas tienen que ser roto en pequeños fragmentos que luego pueden ser secuenciadas individualmente. La digestión se lleva a cabo ya sea por endopeptidasas tales como tripsina o pepsina o por reactivos químicos tales como bromuro de cianógeno. Diferentes enzimas dan diferentes patrones de escisión, y la superposición entre los fragmentos se pueden usar para la construcción de una secuencia general.

    La reacción de degradación de Edman

    El péptido a secuenciar se adsorbe sobre una superficie sólida - un sustrato común es de fibra de vidrio recubierta con polibreno, un polímero catiónico. El reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, se añade al péptido adsorbido, junto con una solución de tampón ligeramente básico de 12% trimetilamina. Este reacciona con el grupo amino del aminoácido N-terminal.

    El aminoácido terminal puede entonces ser separado selectivamente por la adición de ácido anhidro. El derivado entonces isomerises en hacerle un feniltiohidantoina sustituido que se puede lavar y se identificó por cromatografía, y el ciclo se repite. La eficiencia de cada paso es de aproximadamente 98%, lo que permite a aproximadamente 50 aminoácidos a ser determinados con fiabilidad.

    Limitaciones de la degradación de Edman

    Debido a la degradación de Edman los ingresos de la N-terminal de la proteína, no va a funcionar si el aminoácido N-terminal ha sido modificada químicamente o si se oculta dentro del cuerpo de la proteína. También requiere el uso de cualquiera de las conjeturas o un procedimiento separado para determinar las posiciones de los puentes disulfuro.

    La espectrometría de masas

    El otro método directo importante por el cual la secuencia de una proteína se puede determinar es la espectrometría de masas. Este método ha ido ganando popularidad en los últimos años como las nuevas técnicas y el aumento de potencia de cálculo que han facilitado. La espectrometría de masas puede, en principio, la secuencia de cualquier tamaño de la proteína, pero el problema se convierte en computacionalmente más difícil a medida que aumenta el tamaño. Los péptidos también son más fáciles de preparar para la espectrometría de masas de proteínas en su conjunto, debido a que son más solubles. Un método de entrega de los péptidos para el espectrómetro es ionización por electrospray, para el que John Bennett Fenn ganó el Premio Nobel de Química en 2002 - La proteína es digerida por una endoproteasa, y la solución resultante se hace pasar a través de una columna de cromatografía líquida de alta presión. Al final de esta columna, la solución se pulveriza a cabo de una boquilla estrecha cargada con un alto potencial positivo en el espectrómetro de masas. La carga de las gotitas hace que se fragmento hasta que sólo los iones individuales se mantienen. Los péptidos se fragmentan a continuación, y la masa a carga proporciones de los fragmentos medidos .. El espectro de masas se analiza por ordenador y a menudo se compara contra una base de datos de proteínas previamente secuenciados con el fin de determinar las secuencias de los fragmentos. Este proceso se repite a continuación con una enzima de digestión diferente, y los solapamientos en las secuencias se utilizan para construir una secuencia de la proteína.

    Predicción de la secuencia de la proteína a partir de secuencias de ADN/ARN

    En los organismos que no tienen intrones de la secuencia de aminoácidos de una proteína también se puede determinar indirectamente a partir del ARNm o el ADN que codifica para la proteína. Si ya se conoce la secuencia del gen, a continuación, todo esto es muy fácil. Sin embargo, es raro que se conoce la secuencia de ADN de una nueva proteína aislada, y por lo que si este método es para ser usado, tiene que ser encontrado en alguna forma. Una manera en que esto se puede hacer es a la secuencia de una sección corta, tal vez 15 aminoácidos de longitud, de la proteína por uno de los métodos anteriores, y luego utilizar esta secuencia para generar un marcador complementario para el ARN de la proteína. Este luego se puede utilizar para aislar el ARNm que codifica para la proteína, que luego puede ser replicado en una reacción en cadena de la polimerasa para producir una cantidad significativa de ADN, que luego pueden ser secuenciados con relativa facilidad. La secuencia de aminoácidos de la proteína a continuación, se puede deducir de esto. Sin embargo, es necesario tener en cuenta la posibilidad de aminoácidos que son removidos después de que el ARNm ha sido traducido.