Fijación, Propósitos de fijación, Proceso de fijación, Tipos de fijación, Tipos de fijadores químicos, Las secciones congeladas, Target y Química Fijador hacer y no hacer, Factores que afectan la fijación, Enlaces externos

En los campos de la histología, patología, y la biología celular, la fijación es un proceso químico mediante el cual los tejidos biológicos se conservan de la caries, evitando de este modo la autólisis o putrefacción. Fijación termina las reacciones bioquímicas en curso, y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados.

Propósitos de fijación

La fijación del tejido se realiza por varias razones. Una de las razones es para matar el tejido de manera que se evita la descomposición post mortem. Fijación conserva una muestra de material biológico como cerca de su estado natural como sea posible en el proceso de preparación de tejido para su examen. Para lograr esto, por lo general varias condiciones se deben cumplir.

En primer lugar, un fijador normalmente actúa para desactivar intrínseca biomoléculas, particularmente enzimas proteolíticas, que de otro modo digiere o dañe la muestra.

En segundo lugar, un fijador típicamente protege una muestra del daño extrínseco. Fijadores son tóxicos para los microorganismos más comunes que podrían existir en una muestra de tejido o que de otro modo podría colonizar el tejido fijado. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijo para que sea más aceptable para los microorganismos oportunistas.

Por último, fijadores menudo alteran las células o tejidos en un nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o la estabilidad. Este aumento de la resistencia y la rigidez pueden ayudar a preservar la morfología de la muestra a medida que se procesa para su posterior análisis.

Incluso la fijación más cuidado no altera la muestra e introducir artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo destacado es la mesosoma bacteriana, que se pensaba que era un orgánulo en las bacterias gram-positivas en la década de 1970, pero más tarde se demostró por nuevas técnicas desarrolladas para la microscopía electrónica para ser simplemente un artefacto de fijación química. Normalización de fijación y otros procedimientos de procesamiento de tejidos toma esta introducción de artefactos en cuenta, al establecer cuáles son los procedimientos que se introducen tipos de artefactos. Los investigadores que saben qué tipo de artefactos a esperar con cada tipo de tejido y la técnica de procesamiento pueden interpretar con precisión las secciones con los artefactos, o elegir las técnicas que minimizan los artefactos en áreas de interés.

Proceso de fijación

La fijación es por lo general la primera etapa de un proceso de múltiples etapas para preparar una muestra de material biológico para microscopía u otro análisis. Por lo tanto, la elección del fijador y el protocolo de la fijación puede depender de las etapas de procesamiento adicionales y los análisis finales que se han previsto. Por ejemplo, inmunohistoquímica utiliza anticuerpos que se unen a una proteína diana específica. Fijación prolongada puede enmascarar químicamente estos objetivos y evitar la unión de anticuerpos. En estos casos, el método de una "solución rápida" con frío formalina durante unas 24 horas se usa normalmente.

y el material utilizado

Tipos de fijación

En general, existen tres tipos de proceso de fijación:

Fijación por calor: Después de un frotis se ha secado a temperatura ambiente, la corredera es agarrado por pinzas o una pinza de ropa y pasa a través de la llama de un mechero Bunsen varias veces a matar calentar y adherir el organismo a la diapositiva. Utiliza de forma rutinaria con bacterias y arqueas. Fijación por calor generalmente conserva la morfología general, pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica y prevenir la autolisis. Fijación por calor no se puede utilizar en el método de tinción capsular como fijación por calor se encogerá o destruir la cápsula y no puede ser visto en las manchas.

Perfusión: La fijación a través del flujo sanguíneo. El fijador se inyecta en el corazón con el volumen de inyección correspondiente gasto cardíaco. El fijador se extiende por todo el cuerpo, y el tejido no muere hasta que esté arreglado. Esto tiene la ventaja de preservar la morfología perfecta, pero las desventajas que el sujeto muere y el costo es alto

Inmersión: La muestra de tejido se sumerge en fijador de volumen a un mínimo de 20 veces mayor que el volumen del tejido que se ha fijado. El fijador debe difundirse a través del tejido a fijar, lo que el tamaño y la densidad del tejido, así como el tipo de fijador debe ser considerado. Utilizando una muestra más grande significa que se necesita más tiempo para que el fijador para alcanzar el tejido más profundo. Mejor en un ligero vacío.

La fijación química

En este proceso, las estructuras se conservan en un estado lo más cercano a los tejidos vivos como sea posible. Esto requiere un fijador químico que puede estabilizar las proteínas, ácidos nucleicos y mucosustancias del tejido, haciéndolos insolubles.

Tipos de fijadores químicos

Fijadores reticulación - Aldehídos

Fijadores de reticulación actúan mediante la creación de enlaces químicos covalentes entre las proteínas en el tejido. Esto ancla soluble en proteínas al citoesqueleto, y se presta una rigidez adicional al tejido.

Con mucho, el fijador más usado en histología es el formaldehído. Se utiliza por lo general como un 10% neutral formalina tamponada, que es de aprox. 3,7% -4,0% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato. Como el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, gas formalina formol disuelto en agua se utiliza al realizar la primera fijación. El paraformaldehído es una forma polimerizada de formaldehído, que se obtiene generalmente como un polvo blanco fino, que despolimeriza volver a la formalina cuando se calienta. Correcciones de formaldehído tejido mediante la reticulación de las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina. Sus efectos son reversibles, por el exceso de agua y se evita la pigmentación de la formalina. Otros beneficios incluyen: almacenamiento a largo plazo y una buena penetración en el tejido. Es especialmente bueno para las técnicas de inmunohistoquímica. También el vapor de formaldehído se puede utilizar como un fijador para frotis celulares.

Otra aldehído popular para la fijación es glutaraldehído. Se opera de una manera similar a formaldehído al causar la deformación de las estructuras de hélice alfa en las proteínas. Sin embargo glutaraldehído es una molécula más grande, y por lo que su velocidad de difusión a través de membranas es más lento que el formaldehído. En consecuencia la fijación de glutaraldehído en muestras de tejido más grueso puede verse obstaculizado, pero este problema se puede superar mediante la reducción del tamaño de la muestra de tejido. Una de las ventajas de la fijación de glutaraldehído es que se puede ofrecer un producto-su mayor longitud fija más rígido o estrechamente vinculados y dos grupos aldehído permitir que se "puente" y enlace pares más distantes de las moléculas de proteína. Se provoca cambios rápidos e irreversible, correcciones rápidamente, es muy adecuado para microscopía electrónica, fija así a 4 ° C, y da detalles de citoplasmáticas y nucleares mejor en general. Sin embargo, no es ideal para la tinción inmunohistoquímica.

Algunos protocolos de fijación requieren una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivos puntos fuertes se complementan entre sí.

Estos fijadores-especialmente de reticulación de formaldehído-tienden a preservar la estructura secundaria de las proteínas y puede proteger cantidades significativas de estructura terciaria así.

Precipitantes fijadores - Alcoholes

Fijadores precipitantes actúan mediante la reducción de la solubilidad de las moléculas de proteína y mediante la interrupción de las interacciones hidrofóbicas que dan muchas proteínas de su estructura terciaria. La precipitación y la agregación de proteínas es un proceso muy diferente de la reticulación que se produce con los fijadores de aldehído.

Los fijadores precipitantes más comunes son el etanol y el metanol. Comúnmente se utilizan para fijar las secciones y frotis congelados. La acetona también se utiliza y se ha demostrado que produce una mejor preservación histológico de secciones congeladas cuando se emplean en la técnica Xileno metilbenzoato de acetona.

Los desnaturalizantes de proteínas - metanol, etanol y acetona - rara vez se utilizan solos para la fijación de los bloques a menos que el estudio de los ácidos nucleicos.

El ácido acético es un desnaturalizante que se utiliza a veces en combinación con los otros fijadores precipitantes, tales como AFA de Davidson. Los alcoholes, por sí mismos, son conocidos por causar una considerable contracción y endurecimiento del tejido durante la fijación mientras que el ácido acético solo se asocia con la inflamación de tejidos, la combinación de los dos puede resultar en una mejor preservación de la morfología de los tejidos.

Agentes oxidantes

Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con diferentes cadenas laterales de las proteínas y otras biomoléculas, lo que permite la formación de enlaces que estabilizan la estructura del tejido. Sin embargo causan extensa desnaturalización a pesar de la preservación de la estructura celular fina y se utilizan principalmente como agentes de fijación secundarias.

El tetróxido de osmio se utiliza a menudo como un fijador secundario cuando se preparan muestras para microscopía electrónica.

Dicromato de potasio, ácido crómico, permanganato de potasio y todas son útiles en ciertas preparaciones histológicas específicas.

Mercuriales

Mercuriales como B-5 y el fijador de Zenker tienen un mecanismo desconocido que aumenta el brillo de las manchas y dar un detalle excelente nuclear. A pesar de ser rápido, mercuriales penetran mal y producen la contracción del tejido. Su mejor aplicación es para la fijación de los tejidos hematopoyéticos y reticuloendotelial. También tenga en cuenta que, dado que contienen mercurio cuidado hay que tener con la eliminación.

Picratos

Picratos penetran tejido bien para reaccionar con las histonas y proteínas básicas para formar picratos cristalinas con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un buen fijador para el tejido conectivo, conserva bien glucógeno, y extrae los lípidos para dar resultados superiores al formaldehído en la inmunotinción de las hormonas biogénicas y polipéptido Sin embargo, provoca una pérdida de basofilia menos que el espécimen se lava a fondo después de la fijación.

ESPERANZA fijador

Efecto de protección disolvente orgánico ácido glutámico tampón Hepes-mediada da morfología formol-como, excelente conservación de antígenos proteicos para inmunohistoquímica e histoquímica enzimática, buenos rendimientos de ARN y ADN y la ausencia de proteínas de reticulación.

Las secciones congeladas

Pequeños trozos de tejido se colocan en un medio de incrustación crioprotector-OCT, TBS, o Cryogel-a continuación, broche de congelados en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Tejido es entonces seccionado en un micrótomo de congelación o criostato. Las secciones se fijaron a continuación en uno de los siguientes agentes de fijación: acetona absoluta durante 10-15 minutos, 95% de etanol durante 10-15 minutos o acetona absoluta de 10 minutos, seguido de 95% de etanol 10 minutos

Ventajas

  • Dale una mejor preservación de la antigenicidad
  • Exposición mínima al fijador
  • No expuesto a los disolventes orgánicos
  • Mucho más rápido que otras formas de fijaciones.

Desventajas

  • Falta detalle morfológico
  • Presentar un riesgo biológico potencial

Target y Química Fijador hacer y no hacer

  • Secciones congeladas conservan ARN y lípidos a pesar del mal morfología. Compare con secciones de parafina, sinónimo de fijadores químicos en la tabla, que destruyen el ARN y afecta algunos antígenos sino dar buena morfología.

~ A picrato

Factores que afectan la fijación

pH

Debe mantenerse en el rango fisiológico, entre pH 4-9 - El pH de la preservación ultraestructura debe ser amortiguada entre 7,2 a 7,4

Osmolaridad

Las soluciones hipertónicas dan lugar a la contracción de la célula.

Soluciones hipotónicas resultado en la celda hinchazón y la mala fijación.

10% búfer formalina neutra es 4% de formaldehído en cantidades tampón PBS a 1,63 osmolar. Esta es una solución muy hipertónica, sin embargo, ha funcionado bien como una condición de fijación del tejido general para muchos años en los laboratorios de patología.

Tamaño de la muestra

1-4mm Espesor

El volumen del fijador

Por lo menos 15-20 veces mayor que el volumen de tejido

Temperatura

El aumento de la temperatura aumenta la velocidad de fijación. Sin embargo, se requiere cuidado para evitar la cocción de la muestra. La fijación se lleva a cabo habitualmente a temperatura ambiente.

Duración

Como regla general 1 hora por 1 mm

Tiempo de eliminación de Fijación

La fijación es un proceso químico, y el tiempo se debe permitir que el proceso se complete. Aunque "sobre la fijación" puede ser perjudicial, en virtud de la fijación se ha apreciado recientemente como un problema importante y puede ser responsable de los resultados inapropiados para algunos ensayos.

Enlaces externos

  • La fijación de las muestras para la toma de diapositivas permanentes
  • Las estrategias de fijación y formulaciones para la tinción inmunohistoquímica