Transformación, Historia, Métodos y mecanismos, Aspectos prácticos de la transformación de la biología molecular

En la biología molecular, la transformación es la alteración genética de una célula resultante de la absorción directa, la incorporación y expresión del material genético exógeno de su entorno y se recogió a través de la membrana celular. La transformación se produce de forma natural en algunas especies de bacterias, pero también puede verse afectada por medios artificiales en otras células. Para la transformación a suceder, las bacterias deben estar en un estado de competencia, lo que podría ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a las condiciones ambientales, tales como el hambre y la densidad celular. La transformación es uno de los tres procesos por los que el material genético exógeno se puede introducir en una célula bacteriana, siendo las otras dos conjugación y transducción. "Transformación" también puede ser usado para describir la inserción de nuevo material genético en las células no bacterianas, incluyendo las células de plantas y animales, sin embargo, debido a que "transformación" tiene un significado especial en relación con las células animales, lo que indica la progresión a un estado canceroso, el término debe evitarse para las células animales cuando se describe la introducción de material genético exógeno. La introducción de ADN extraño en células eucariotas a menudo se llama "transfección".

Historia

La transformación se demostró por primera vez en 1928 por el bacteriólogo británico Frederick Griffith. Griffith descubrió que una cepa inofensiva de Streptococcus pneumoniae podría hacerse virulenta después de haber sido expuestos a cepas virulentas muertas por calor. Griffith planteó la hipótesis de que algunos "principio de transformación" de la cepa de muertos por calor era responsable de hacer la cepa virulenta inofensivos. En 1944, este "principio transformante" se identificó como genética por Oswald Avery, Colin MacLeod y McCarty Maclyn. Se aisló el ADN de una cepa virulenta de S. pneumoniae y usando sólo este ADN fueron capaces de hacer una cepa virulenta inofensivos. Llamaron a este captación e incorporación de ADN por las bacterias "transformación". Los resultados de los experimentos de Avery et al. 'S fueron al principio con escepticismo recibida por la comunidad científica y no fue hasta el desarrollo de marcadores genéticos y el descubrimiento de otros métodos de transferencia genética por Joshua Lederberg que se aceptaron los experimentos de Avery.

Originalmente se pensó que la Escherichia coli, un organismo de laboratorio de uso general, fue refractaria a la transformación. Sin embargo, en 1970, Morton Mandel y Higa Akiko demostraron que la E. coli pueden ser inducidos a tomar DNA del bacteriófago? sin el uso de fago auxiliar después del tratamiento con una solución de cloruro de calcio. Dos años después, en 1972, Stanley Cohen, Annie Chang y Leslie Hsu CaCl2 mostraron que el tratamiento es también eficaz para la transformación de ADN plásmido. El método de transformación por Mandel y Higa fue posteriormente mejorada por Douglas Hanahan. El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en E. coli creado un procedimiento eficaz y conveniente para la transformación de las bacterias que permite métodos de clonación moleculares más simples en la biotecnología y la investigación, y ahora es un procedimiento de laboratorio utilizado rutinariamente.

Transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de 1980, el aumento de la eficacia de la transformación in vitro y aumentar el número de cepas bacterianas que se podrían transformar. La transformación de células animales y vegetales también se investigó con el primer ratón transgénico está creado mediante la inyección de un gen de una hormona del crecimiento de rata en un embrión de ratón en 1982. En 1907 una bacteria que causa tumores de plantas, Agrobacterium tumefaciens, y se descubrió en la década de 1970 se descubrió que el agente inductor de tumor para ser un plásmido de ADN llamado el plásmido Ti. Mediante la eliminación de los genes en el plásmido que causó el tumor y la adición de nuevos genes en los investigadores fueron capaces de infectar las plantas con A. tumefaciens y dejar que las bacterias insertan su ADN elegido en los genomas de las plantas. No todas las células de las plantas son susceptibles a la infección por A. tumefaciens para que otros métodos se desarrollaron incluyendo electroporación y microinyección. El bombardeo de partículas se hizo posible con la invención de la partícula Sistema de entrega biolística por John Sanford en la década de 1980.

Métodos y mecanismos

Bacteria

La transformación bacteriana puede ser denominado como un cambio genético estable provocada por la captación de ADN desnudo y la competencia se refiere al estado de ser capaz de captar ADN exógeno desde el medio ambiente. Hay dos formas de transformación y competencia: naturales y artificiales.

 Transformación natural

Transformación natural es una adaptación de las bacterias para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes de bacterias cuyos productos parecen ser diseñados para llevar a cabo este proceso. En general, la transformación es un complejo, la energía que requiere proceso de desarrollo. Para que una bacteria de obligar, absorber y recombinar ADN exógeno en su cromosoma debe ser competente, es decir, entrar en un estado fisiológico especial. El desarrollo de competencias en Bacillus subtilis requiere la expresión de unos 40 genes. El ADN integrado en el cromosoma del huésped se deriva generalmente de otra bacteria de la misma especie, y por lo tanto es homóloga al cromosoma residente.

En B. subtilis, la longitud del ADN transferido es mayor que 1.271 kb. La longitud transferida es probable ADN de doble cadena y es a menudo más de un tercio de la longitud del cromosoma total de 4.215 kb. Parece que alrededor del 7-9% de las células receptoras tome un cromosoma entero.

La capacidad de transformación natural parece ocurrir en un número de procariotas, y hasta el momento se conocen 67 especies procarióticas que someterse a este proceso.

La competencia para la transformación es típicamente inducida por la alta densidad de las células y/o limitación nutricional, afecciones asociadas con la fase estacionaria de crecimiento bacteriano. Transformación en Haemophilus influenzae se produce más eficientemente al final del crecimiento exponencial como el crecimiento bacteriano se aproxima a la fase estacionaria. Transformación en Streptococcus mutans, así como en muchos otros estreptococos, se produce a alta densidad celular y se asocia con la formación de biopelículas. Competencia en B. subtilis se induce hacia el final de crecimiento logarítmico, especialmente en condiciones de limitación de aminoácidos.

 Transformación, como una adaptación para la reparación del ADN

Competencia es inducida específicamente por las condiciones que dañan el ADN. Por ejemplo, la transformación se induce en Streptococcus pneumoniae por el ADN agentes perjudiciales mitomicina C y fluoroquinolonas. En B. subtilis, la transformación se incrementó por la luz UV, un agente que daña el ADN. En Helicobacter pylori, ciprofloxacina, que interactúa con la ADN girasa y presenta roturas de doble cadena, induce la expresión de los genes de competencia, aumentando así la frecuencia de transformación utilizando Legionella pneumophila, Charpentier et al. probado 64 moléculas tóxicas para determinar cuál de estos inducir competencia. De éstos, sólo seis, todos los agentes que dañan el ADN causados fuerte inducción. Estos agentes que dañan el ADN eran mitomicina C, norfloxacina, ofloxacina y ácido nalidíxico, bicyclomycin, e hidroxiurea. Luz ultravioleta también indujo la competencia en L. pneumophila. Charpentier et al. sugirió que la competencia para la transformación probablemente evolucionó como una respuesta al daño del ADN.

Bacterias crecimiento logarítmico diferir de bacterias en fase estacionaria con respecto al número de copias del genoma presentes en la célula, y esto tiene implicaciones para la capacidad para llevar a cabo un proceso importante de reparación del ADN. Durante el crecimiento logarítmica, dos o más copias de una región particular del cromosoma pueden estar presentes en una célula bacteriana, como la división celular no se corresponde precisamente con la replicación del cromosoma. El proceso de reparación de recombinación homóloga es un proceso de reparación del ADN clave que es especialmente eficaz para la reparación de daños de doble cadena, tales como roturas de doble cadena. Este proceso depende de una segunda homóloga en el cromosoma además del cromosoma dañado. Durante el crecimiento logarítmica, un daño en el ADN en un cromosoma puede ser reparado por HRR utilizando información de la secuencia desde el otro cromosoma homólogo. Una vez que las células acercarse a la fase estacionaria, sin embargo, por lo general tienen sólo una copia del cromosoma, y HRR requiere de entrada de la plantilla homóloga desde fuera de la célula por transformación.

Para probar si la función de adaptación de la transformación es la reparación de daños de ADN, una serie de experimentos se llevó a cabo utilizando B. subtilis irradiados por luz UV como el agente que daña Los resultados de estos experimentos indicaron que la transformación de actos de ADN para reparar los daños de ADN potencialmente letales introdujo por la luz UV en el ADN receptor. El proceso en particular responsable de la reparación era HRR probable. Transformación de las bacterias puede ser visto como un proceso sexual primitiva, ya que implica la interacción de ADN homóloga a partir de dos individuos para formar ADN recombinante que se transmite a generaciones sucesivas. La transformación bacteriana en procariotas puede haber sido el proceso ancestral que dio origen a la reproducción sexual meiótica en eucariotas

Aproximadamente el 1% de las especies de bacterias son capaces de tomar forma natural el ADN en condiciones de laboratorio, más puede ser capaz de tomar en sus ambientes naturales. Material de ADN se puede transferir entre diferentes cepas de bacterias, en un proceso que se llama transferencia horizontal de genes. Algunas de las especies sobre la muerte celular liberan su ADN para ser ocupado por otras células, sin embargo, la transformación funciona mejor con el ADN de especies estrechamente relacionadas. Estas bacterias naturalmente competentes llevan conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria de la proteína para llevar ADN a través de la membrana celular. El transporte del ADN exógeno en las células puede requerir proteínas que están implicadas en el ensamblaje de pili de tipo IV y el sistema de secreción de tipo II, así como complejo de translocasa de ADN en la membrana citoplasmática.

Debido a las diferencias en la estructura de la envoltura celular entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hay algunas diferencias en los mecanismos de captación de ADN en estas células, sin embargo la mayoría de ellos comparten características comunes que implican proteínas relacionadas. El ADN se une primero a la superficie de las células competentes en un receptor de ADN, y pasa a través de la membrana citoplásmica a través de translocasa ADN. Sólo el ADN de cadena sencilla puede pasar a través de, por lo tanto, una hebra es degradado por las nucleasas presentes en el proceso, y el ADN de hebra sencilla translocado puede entonces ser integrado en los cromosomas bacterianos por un proceso dependiente de RecA. En las células Gram-negativas, debido a la presencia de una membrana adicional, el ADN requiere la presencia de un canal formado por secretins en la membrana externa. Pilin puede ser necesaria para la competencia sin embargo, su papel es incierto. La captación de ADN es generalmente no-secuencia específica, aunque en algunas especies la presencia de secuencias específicas de captación de ADN puede facilitar la captación de ADN eficiente.

 Competencia Artificial

Competencia artificial puede ser inducida en los procedimientos de laboratorio que implican toma de la célula pasiva permeable al ADN mediante su exposición a las condiciones que no se producen normalmente en la naturaleza. Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes, más comúnmente solución de cloruro de calcio bajo condiciones frías, y luego se expusieron a un pulso de choque térmico. Sin embargo, el mecanismo de la absorción de ADN a través de la competencia inducida químicamente en este método de transformación de cloruro de calcio es poco claro. La superficie de las bacterias tales como E. coli está cargado negativamente debido a los fosfolípidos y lipopolisacáridos en su superficie celular, y el ADN también está cargado negativamente. Por lo tanto, una función del catión divalente sería la de proteger a los cargos por la coordinación de los grupos fosfato y otras cargas negativas, permitiendo de ese modo una molécula de ADN que se adhieren a la superficie de la célula. Se sugiere que la exposición de las células a los cationes divalentes en condiciones de frío también puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular de las células por lo que es más permeable al ADN. Se cree que el-pulso de calor para crear un desequilibrio térmico a ambos lados de la membrana celular, lo que obliga al ADN para entrar en las células a través de los poros ya sea celular o la pared celular dañado.

La electroporación es otro método de promoción de la competencia. En este método las células se sorprenden brevemente con un campo eléctrico de 10-20 kV/cm, que se piensa para crear agujeros en la membrana celular a través del cual puede entrar el ADN plásmido. Después de la descarga eléctrica de los agujeros se cierran rápidamente por los mecanismos de reparación de la membrana de la célula.

Levadura

La mayoría de las especies de levaduras, incluyendo Saccharomyces cerevisiae, pueden ser transformadas por el ADN exógeno en el medio ambiente. Varios métodos han sido desarrollados para facilitar esta transformación a alta frecuencia en el laboratorio.

 La transformación de esferoplastos

Las células de levadura se pueden tratar con enzimas para degradar sus paredes celulares, produciendo esferoplastos. Estas células son muy frágiles, pero ocupan ADN extraño a una velocidad alta.

 La transformación de células de levadura intactas

La exposición de células de levadura intactas a los cationes alcalinos, tales como los de cesio o de litio permite que las células absorban ADN plásmido. Más tarde protocolos adaptados este método de transformación, utilizando acetato de litio, polietilenglicol, y ADN de una sola hebra. En estos protocolos, el ADN de una sola hebra se une preferentemente a la pared celular de la levadura, la prevención de ADN plásmido de hacerlo y dejándolo disponible para la transformación.

 Otros métodos de transformación de levadura

La digestión enzimática, electroporación, o agitación con perlas de vidrio también se pueden usar para transformar células de levadura.

Plantas

Un número de métodos están disponibles para la transferencia de ADN en células de plantas:

  • La transformación mediada por Agrobacterium es la transformación de la planta más fácil y más sencillo. Tejidos vegetales se cortan en trozos pequeños, por ejemplo, 10x10mm, y se sumergen durante 10 minutos en un fluido que contiene en suspensión de Agrobacterium. Algunas células a lo largo del corte serán transformados por la bacteria, que inserta su ADN en la célula. Colocado en medio de enraizamiento seleccionables y disparar, las plantas vuelven a crecer. Algunas especies de plantas pueden ser transformadas sólo por inmersión de las flores en suspensión de Agrobacterium y a continuación, la plantación de las semillas en un medio selectivo. Desafortunadamente, muchas plantas no son transformables por este método.
  • Pistola génica: También se conoce como el bombardeo de partículas, el bombardeo con microproyectiles o biolística. Las partículas de oro o tungsteno se recubren con ADN y luego dispararon en células de plantas jóvenes o embriones de plantas. Parte del material genético se quedará en las células y transformarlas. Este método también permite la transformación de plastidios de plantas. La eficiencia de transformación es menor que en la transformación mediada por Agrobacterium, pero la mayoría de las plantas puede ser transformada con este método.
  • Electroporación: hacer agujeros transitorios en las membranas celulares utilizando una descarga eléctrica, lo que permite que el ADN para entrar como se ha descrito anteriormente para las bacterias.
  • Transformación viral: Paquete la deseada material genético en un virus de planta adecuado y permitir que este virus modificado para infectar la planta. Si el material genético es ADN, puede recombinarse con los cromosomas para producir células transformantes. Sin embargo la mayoría de los genomas de virus de plantas consisten de ARN de hebra única que se replica en el citoplasma de la célula infectada. Para tales genomas este método es una forma de transfección y no una transformación real, ya que los genes insertados nunca llegan al núcleo de la célula y no se integran en el genoma del huésped. La progenie de las plantas infectadas está libre de virus y también libre del gen insertado.

Animales

La introducción de ADN en células animales se suele llamar la transfección, y se describe en el artículo correspondiente.

Aspectos prácticos de la transformación de la biología molecular

 Más información: Eficacia de la transformación

El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en bacterias permiten que las bacterias tales como Escherichia coli, para ser utilizados como un anfitrión conveniente para la manipulación de ADN, así como las proteínas que expresan. Típicamente plásmidos se utilizan para la transformación en E. coli. Con el fin de ser mantenido establemente en la célula, una molécula de ADN plásmido debe contener un origen de replicación, lo que le permite replicarse en la célula independientemente de la replicación del propio cromosoma de la célula.

La eficiencia con la que una cultura competente puede captar ADN exógeno y expresar sus genes se conoce como la eficiencia de transformación y se mide en unidades formadoras de colonias por g de ADN utilizado. Una eficiencia de transformación de 1x108 ufc/g para un pequeño plásmido pUC19 como es más o menos equivalente a 1 en 2.000 moléculas de la plásmido utilizado está transformado.

En la transformación de cloruro de calcio, las células se preparan por las células de enfriamiento en presencia de Ca2 toma de la célula se hacen permeables al ADN plásmido. Las células se incubaron en hielo con el ADN, y luego brevemente de shock de calor. Este método funciona muy bien para el ADN plásmido circular. Normalmente preparaciones no comerciales deben dar 106 a 107 transformantes por microgramo del plásmido, una mala preparación será de aproximadamente 104/g o menos, pero una buena preparación de células competentes puede dar hasta ~ 108 colonias por microgramo del plásmido. Sin embargo existen protocolos para la toma de células supercompetentes que pueden dar una eficiencia de transformación de más de 109. El método químico, sin embargo, por lo general no funciona bien para el ADN lineal, tales como fragmentos de ADN cromosómico, probablemente porque las enzimas exonucleasa nativas de la célula se degradan rápidamente ADN lineal. En contraste, las células que son naturalmente competentes se transforman por lo general de manera más eficiente con el ADN lineal que con el ADN plásmido.

La eficiencia de transformación utilizando el método de CaCl2 disminuye con el tamaño del plásmido, y por lo tanto la electroporación puede ser un método más eficaz para la captación de ADN plásmido grande. Las células utilizadas en la electroporación deben estar preparados primero por el lavado en agua doblemente destilada fría para eliminar las partículas cargadas que pueden crear chispas durante el proceso de electroporación.

Selección y transformación de cribado en el plásmido

Debido a la transformación por lo general produce una mezcla de relativamente pocas células transformadas y una abundancia de células no transformadas, es necesario un procedimiento para seleccionar para las células que han adquirido el plásmido. El plásmido tanto, requiere un marcador seleccionable tal que esas células sin plásmido pueden ser asesinados o tienen su crecimiento detenido. La resistencia a antibióticos es el marcador más comúnmente utilizado para los procariotas. El plásmido contiene la transformación de un gen que confiere resistencia a un antibiótico que las bacterias son de otra manera sensibles a. La mezcla de las células tratadas se cultivan en medios que contienen el antibiótico de manera que sólo las células transformadas son capaces de crecer. Otro método de selección es el uso de ciertos marcadores auxotróficos que puede compensar una incapacidad para metabolizar ciertos aminoácidos, nucleótidos, o azúcares. Este método requiere el uso de cepas adecuadamente mutados que son deficientes en la síntesis o la utilidad de una biomolécula en particular, y las células transformadas se cultivan en un medio que permite que sólo las células que contienen el plásmido para crecer.

En un experimento de clonación, un gen puede insertarse en un plásmido utilizado para la transformación. Sin embargo, en el experimento de este tipo, no todos los plásmidos pueden contener un gen insertado con éxito. Por lo tanto, las técnicas adicionales se pueden emplear además para la detección de las células transformadas que contienen el plásmido con el inserto. Los genes indicadores pueden ser utilizados como marcadores, tales como el gen lacZ que codifica para la-galactosidasa utilizado en el cribado azul-blanco. Este método de detección se basa en el principio de un-complementación, donde un fragmento del gen lacZ en el plásmido puede complementar otro gen lacZ mutante en la célula. Ambos genes por sí mismos producen péptidos no funcionales, sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZ-una se transforma en un lacZ células? M15, forman una funcional-galactosidasa. La presencia de una activa-galactosidasa se puede detectar cuando las células se cultivan en placas que contenían X-gal, la formación de colonias azules característicos. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple, en donde un gen de interés se puede ligar en el vector de plásmido, se encuentra dentro del gen lacZa. Por lo tanto, la ligadura con éxito interrumpe el gen lacZa, y no es funcional-galactosidasa puede formar, dando como resultado colonias de color blanco. Las células que contienen inserto se ligaron con éxito pueden ser fácilmente identificados por su coloración blanca de las fracasadas los azules.

Otros genes indicadores comúnmente utilizados son la proteína fluorescente verde, que produce las células que aparecen en verde bajo la luz azul, y la enzima luciferasa, que cataliza una reacción con luciferina para emitir luz. El ADN recombinante también puede detectarse mediante otros métodos tales como la hibridación de ácidos nucleicos con la sonda de ARN radiactiva, mientras que las células que expresan la proteína deseada a partir del plásmido también se pueden detectar usando métodos inmunológicos.