Respirometría, Tasas metabólicas Whole-animal, Tasas metabólicas mitocondriales

Respirometría es un término general que abarca una serie de técnicas para la obtención de estimaciones de las tasas de metabolismo de los vertebrados, invertebrados, plantas, tejidos, células o microorganismos a través de una medida indirecta de la producción de calor.

Tasas metabólicas Whole-animal

El metabolismo de un animal se estima mediante la determinación de las tasas de producción de dióxido de carbono y el consumo de oxígeno de los animales individuales, ya sea en un sistema cerrado o un sistema de respirometría de circuito abierto. Dos medidas se obtienen típicamente: la tasa metabólica basal y estándar o tasa máxima. SMR se mide mientras el animal está en reposo bajo condiciones específicas de las materias, la edad, el estado de reproducción, después de la absorción para evitar efecto térmico de los alimentos) de laboratorio específicas. VO2max se determina normalmente durante el ejercicio aeróbico en o cerca de los límites fisiológicos. En contraste, la tasa metabólica campo se refiere a la tasa metabólica de un, animal activo sin restricciones en la naturaleza. Tasas metabólicas entero de animales se refieren a estas medidas sin corrección de la masa corporal. Si los valores de SMR o BMR se dividen por el valor de masa corporal para el animal, entonces la tasa se denomina masa específica. Es este valor de la masa específica de que uno normalmente se oye en las comparaciones entre las especies.

Respirometría Cerrado

Respirometría depende de "lo que entra tiene que salir". Considere la posibilidad de un sistema cerrado en primer lugar. Imaginemos que colocamos un ratón en un recipiente hermético. El aire sellada en el recipiente contiene inicialmente la misma composición y las proporciones de los gases que estaban presentes en la habitación: 20,95% de O2, 0,03% de CO2, vapor de agua, 78% de N2, y una variedad de trazas de gases que componen el resto. A medida que pasa el tiempo, el ratón en la cámara produce CO2 y vapor de agua, pero los extractos de O2 del aire en proporción a sus necesidades metabólicas. Por lo tanto, el tiempo que sabemos el volumen del sistema, la diferencia entre las concentraciones de O2 y CO2 en el inicio cuando sellamos el ratón en la cámara en comparación con las cantidades presentes después de que el ratón se ha respirado el aire en un momento posterior debe serán las cantidades de CO2/O2 producido/consumido por el ratón. En un sistema cerrado, el medio ambiente con el tiempo se convertirá en la hipoxia.

Respirometría abierta

Para un sistema abierto, restricciones de diseño incluyen características de lavado de la cámara de los animales y la sensibilidad de los analizadores de gas. Sin embargo, el principio básico es el mismo: Lo que entra debe salir. La distinción principal entre un sistema abierto y cerrado es que el sistema abierto de aire fluye a través de la cámara a una velocidad que se completa constantemente el O2 agotados por el animal mientras se quita el CO2 y el vapor de agua producido por el animal. La velocidad de flujo debe ser lo suficientemente alta para asegurar que el animal nunca se consume todo el oxígeno presente en la cámara mientras que al mismo tiempo, la tasa debe ser lo suficientemente bajo como para que el animal consume suficiente O2 para la detección. Para un ratón 20 g, tasas de flujo de aproximadamente 200 ml/min a través de contenedores de 500 ml proporcionaría un buen equilibrio. En este caudal, aproximadamente 40 ml de O2 se lleva a la cámara y todo el volumen de aire en la cámara se intercambia el plazo de 5 minutos. Para otros animales más pequeños, el volumen de la cámara pueden ser mucho más pequeño y velocidades de flujo se ajusta hacia abajo también. Tenga en cuenta que para los animales de sangre caliente o endotérmica, tamaños de la cámara y o caudales ser seleccionado sería para dar cabida a sus tasas metabólicas más altas.

 Cálculos

Cálculo de tasas de VO2 y/o VCO2 requiere el conocimiento de las velocidades de flujo dentro y fuera de la cámara, además de las concentraciones fraccionales de las mezclas de gas dentro y fuera de la cámara de animales. En general, las tasas metabólicas se calculan a partir de las condiciones de estado estacionario, se divide el volumen en el tiempo necesario para viajar entre las marcas y el resultado es la velocidad de flujo. Estos instrumentos se pueden comprar a partir de una variedad de fuentes, pero también pueden ser construidos a partir de tamaño apropiado, de vidrio pipetas volumétricas.

  • Medidores de flujo de acrílico: Bajo algunas circunstancias de altos caudales que pueden utilizar los medidores de flujo de acrílico simples para controlar las velocidades de flujo a través de las cámaras metabólicas. Los medidores están ubicados aguas arriba de las cámaras metabólicas. Los medidores de flujo son simples de usar, pero deben ser calibrados dos veces al día para el uso en el sistema de respirometría: una vez antes de que comience la grabación y de nuevo al final de la grabación. La calibración debe realizarse con un medidor de flujo de burbuja debido a las marcas de calibración en los medidores acrílicos son sólo aproximados. Para la calibración adecuada de las tasas de flujo de tener en cuenta que tanto la presión barométrica y la temperatura de la corriente de aire a través del medidor de flujo deben ser registrados.
  • Medidores de flujo másico: Las ecuaciones necesarias para calcular las tasas de consumo de oxígeno o la producción de dióxido de carbono suponen que los caudales de entrada y salida de las cámaras se conocen con exactitud. Utilizamos medidores de flujo másico que tienen la ventaja de velocidades de flujo de rendimiento independientes de la temperatura y la presión del aire. Por lo tanto, estas tasas de flujo pueden ser considerados para ser corregido a condiciones estándar. Sólo medimos y controlamos el flujo en un solo lugar-aguas abajo de la cámara. Por lo tanto, debemos suponer que las tasas de entrada y salida son idénticos. Sin embargo, durante la construcción del sistema de respirometría, velocidad de flujo se debe medir en todos los pasos, a través de todas las conexiones, para verificar la integridad de flujo.
  • Las válvulas de aguja: medidores de flujo de masa se pueden comprar con los controladores de flujo de masa que permiten fijar las tasas de flujo. Estos son caros, sin embargo. Investigación respirometría menudo intentará medir más de un animal a la vez, lo que requeriría una cámara controlada por animal y por lo tanto el flujo a través de cada cámara. Un método alternativo y más rentable para el flujo de control serían a través de acero inoxidable o de válvulas de aguja de acero al carbono. Las válvulas de aguja, más medidores de flujo másico proporciona un medio rentable de alcanzar velocidades de flujo deseadas. Las válvulas cuestan alrededor de $ 20.
  • Tubos y cámaras

    • Tubos y conexiones: Hay varios tipos de tubos se pueden usar para conectar los componentes del sistema de respirometría hacia y desde la cámara de animales. Una variedad de tipos de tubo flexible se puede utilizar, en función de las características del sistema. Acetil, Bev-A-Line, Kynar, nylon, tubos Tygon y conectores se pueden utilizar en regiones del sistema en atmósferas oxidantes son bajos; tubo de teflón se recomienda si hay una expectativa de cantidades apreciables de ozono para estar presente, ya que es inerte al ozono. Tubos de teflón son más costosos y flexibilidad falta.
    • Cámaras metabólicas: Cámaras pueden ser frascos de vidrio con tapones de goma para las tapas, jeringas para pequeños animales e insectos, o construido a partir de plexiglás. Idealmente, las cámaras deben ser construidos a partir de materiales inertes, por ejemplo, los plásticos acrílicos pueden absorber O2 y pueden ser una mala elección para respirometría con insectos muy pequeños. Cámaras deben ser construidas de una manera que produce un mezclado rápido de los gases dentro de la cámara. La cámara metabólica más simple para un pequeño vertebrado puede ser un frasco de vidrio con un tapón. Los tapones están equipados con dos puertos: extensiones cortas de tubo de teflón se proporcionan para conexiones de línea. Extensiones de tubo de teflón son empujados a través del mamparo y la conexión de la línea se terminaron mediante la unión de una pequeña abrazadera de la manguera a la base de la extensión del tubo de Teflón. Además, una extensión al puerto de entrada en el interior del frasco debe proporcionarse-esto asegura que los gases espiratorios del animal no son arrastradas por la corriente de flujo en. El animal está sellado interior y el tapón de goma se sujeta con correas de velcro. Si se utiliza un sistema de aguas arriba, cualquier fuga cámara metabólica resultará en la pérdida de aire de los animales y, por lo tanto, una subestimación de la tasa metabólica del animal. Cuando se cierra un animal dentro de una cámara metabólica, se debe prestar atención a la junta. Para asegurar un sellado hermético antes de cerrar la tapa, trabajar firmemente el tapón en el frasco y asegúrese de que es aún. Use 1-2 correas y tire con fuerza. Cámaras de acrílico se construirán para algunos usos, pero se necesitarán ingeniería precisa para asegurar un asiento adecuado, juntas va a ayudar, y el uso juicioso de las abrazaderas apretadas reducirán al mínimo las fugas.
    • Fregar tubos: Agua antes y después de la cámara de los animales debe ser eliminado. Una disposición sería utilizar una columna de acrílico grande de Drierite aguas arriba para secar los tubos de corriente de aire y varios incurrentes con Drierite malla más pequeña para eliminar el agua después de la cámara de animales. Para preparar un tubo de lavado, asegúrese de que haya una pequeña cantidad de algodón en los extremos del tubo para evitar que las partículas de polvo que viajan a los analizadores. Utilice pequeñas cantidades de algodón, es decir, aproximadamente 0.005 g, lo suficiente para mantener el polvo fuera de la tubería. Grandes cantidades de algodón se bloquee el flujo de aire cuando/si se humedece. Vierta la Drierite en el tubo con un embudo, toque el tubo en el banco para empacar los granos con fuerza, y coronar con una pequeña cantidad de algodón. Para eliminar el dióxido de carbono] antes y después de la cámara de los animales, se utiliza Ascarita II. Ascarita II contiene NaOH, que es cáustico. Un tubo de lavado se prepara mediante la colocación de una pequeña cantidad de algodón en el extremo del tubo, llenado un tercio de la manera con malla 10-20 Drierite, la adición de una pequeña cantidad de algodón, a continuación, una tercera adicional del tubo con la Ascarita II, otra capa de algodón, seguido por más Drierite y tapado del tubo con otra pequeña cantidad de algodón. Toque en el tubo en el banco como se agrega cada capa para empacar los granos. Nota: Driereite se puede utilizar una y otra vez, a pesar de lo que indica Drierite perderá color con repetidas secado; Ascarita II se utiliza una vez y se considera un residuo peligroso.

    Analizadores

    • Analizador de dióxido de carbono: los analizadores de CO2 suelen utilizar métodos de detección basados en infrarrojos para aprovechar el hecho de que el CO2 va a absorber la luz infrarroja y volver a emitir luz a longitudes de onda ligeramente más largos. El medidor de panel en el analizador muestra en toda la 0,01 - Rango de CO2 del 10% y una tensión de salida proporcional a la concentración de CO2 también se genera para la grabación de datos.
    • Analizador de oxígeno: Los analizadores de oxígeno adecuados para respirometría utilizan una variedad de sensores de oxígeno, incluyendo galvánica, paramagnético, polarografía y sensores de circonio. Analizadores de O2 galvánico utilizan una pila de combustible que contiene un electrolito ácido, un ánodo de metal pesado y una membrana permeable a los gases delgada. Puesto que la presión parcial de O2 cerca del ánodo es cero, O2 es impulsado por difusión al ánodo a través de la membrana a una velocidad proporcional a la presión parcial de O2 ambiente. La célula de combustible produce una tensión linealmente proporcional a la presión parcial de O2 en la membrana. Mientras temperatura de la cámara es estable, y siempre que el flujo de aire a través de la pila de combustible es estable y dentro del alcance, la respuesta será del 0,01% o más dependiendo de la electrónica de apoyo, software, y otras consideraciones.

    Finalmente, un equipo de adquisición de datos y sistema de control sería una adición típica para completar el sistema. En lugar de un registrador de gráficos, registros continuos de consumo de oxígeno y producción de dióxido de carbono o se realizan con la ayuda de un convertidor analógico a digital acoplado a un ordenador. Capturas de software, filtros, convierte y muestra la señal adecuada a las necesidades del experimentador. Una variedad de empresas y servicios a los individuos la comunidad respirometría.

    Tasas metabólicas mitocondriales

    En el interior del cuerpo se entrega oxígeno a las células y en las células a las mitocondrias, donde se consume en el proceso de generación de la mayor parte de la energía requerida por el organismo. Respirometría mitocondrial mide el consumo de oxígeno por la mitocondria sin la participación de todo un animal vivo, y es la principal herramienta para estudiar la función mitocondrial. Tres tipos diferentes de muestras pueden ser sometidos a tales estudios respirométricos: células permeabilizadas mitocondrias aisladas permeabilized fibras o tejidos en los dos últimos casos, la membrana celular se hace permeable mediante la adición de productos químicos que salen de forma selectiva la membrana mitocondrial intacta. Por lo tanto, los productos químicos que normalmente no serían capaces de atravesar la membrana de la célula pueden influir directamente en la mitocondria. Por la permeabilización de la membrana celular de la célula deja de existir un organismo vivo, definido dejando sólo la mitocondria como estructuras todavía funcionales. A diferencia de respirometría todo-animal, respirometría mitocondrial se lleva a cabo en solución, es decir, la muestra se suspende en un medio. Hoy respirometría mitocondrial se realiza principalmente con un enfoque de cámara cerrada.

    Sistema cerrado de cámara

    La muestra en suspensión en un medio adecuado se coloca en una cámara metabólica herméticamente cerrado. Las mitocondrias se ponen en definida "estados" por la adición secuencial de sustratos o inhibidores. Dado que el consumo de oxígeno mitocondrias, la concentración de oxígeno baja. Este cambio de la concentración de oxígeno es registrada por un sensor de oxígeno en la cámara. A partir de la tasa de la disminución de oxígeno la tasa respiratoria de las mitocondrias puede ser calculado.

    Aplicaciones

     La investigación básica

    El funcionamiento de las mitocondrias se estudia en el campo de la bioenergética. Las diferencias funcionales entre las mitocondrias de diferentes especies se estudian por respirometría como un aspecto de la fisiología comparativa.

     La investigación aplicada

    Respirometría mitocondrial se utiliza para estudiar la funcionalidad mitochodrial en enfermedades mitocondriales o enfermedades con un fuerte vínculo con las mitocondrias, por ejemplo, la diabetes mellitus tipo 2, obesidad y cáncer. Otros campos de aplicación son, por ejemplo, ciencias del deporte y la conexión entre la función mitocondrial y envejecimiento.

    Equipo

    El equipo habitual incluye una cámara de sellado capaz metabólico, un sensor de oxígeno, y los dispositivos de grabación de datos, agitación, termostatización y una forma de introducir los productos químicos en la cámara. Como se ha descrito anteriormente para respirometría todo el animal de la elección de los materiales es muy importante. Los materiales plásticos no son adecuados para la cámara debido a su capacidad de almacenamiento de oxígeno. Cuando los materiales plásticos son polímeros que pueden usarse inevitables con una permeabilidad muy baja de oxígeno. La difusión de oxígeno restante en o fuera de los materiales de la cámara se puede manejar mediante la corrección de los flujos de oxígeno medidos para el flujo de oxígeno instrumental de fondo. El instrumento completo que comprende los componentes mencionados a menudo se llama una oxygraph. Las empresas proveedoras de equipos para rspirometry conjunto de animales antes mencionados son por lo general no participan en respiromety mitocondrial. La comunidad cuenta con los servicios en muy diversos niveles de precio y sofisticación por empresas como Oroboros Instruments, Hansatech, respirometer Sistemas y Aplicaciones, YSI Ciencias de la Vida o Instrumentos Strathkelvin.