c-Raf, Descubrimiento, Estructura, Relaciones evolutivas, Regulación de la actividad, Enfermedades humanas asociadas, Papel en el cáncer, Como un objetivo terapéutico, Lista de las proteínas que interactúan

RAF proto-oncogén serina/treonina quinasa-proteína también conocidos como proto-oncogen c-RAF o simplemente c-Raf o incluso Raf-1 es una enzima que en los humanos está codificada por el gen RAF1. La proteína c-Raf es parte de la vía ERK1/2 como una MAP quinasa quinasa quinasa que actúa aguas abajo de la subfamilia Ras de GTPasas de membrana asociados. C-Raf es un miembro de la familia Raf quinasa de serina/treonina-quinasas de proteínas específicas, de entre el grupo TKL de quinasas.

Descubrimiento

El gen Raf puño, v-Raf se encontró en 1983 - Fue aislado del retrovirus murino que lleva el número 3611 - Pronto se demostró que era capaz de transformar fibroblastos de roedores a líneas de células cancerosas, por lo que este gen se le dio el nombre de virus inducida rápidamente acelerado fibrosarcoma. Un año más tarde, se encontró con otro gen transformante en el MH2 retrovirus aviar, llamado v-Mil - que resultó ser muy similar a v-Raf. Los investigadores fueron capaces de demostrar que estos genes codifican enzimas que tienen actividad de serina-treonina quinasa. Homólogos celulares normales de v-Raf y v-Mil pronto se encontraron tanto en el ratón y el genoma del pollo, y se hizo evidente que estos también tienen un papel en la regulación del crecimiento y la división celular. Ahora sabemos que el c-Raf es un componente principal de la primera descrito la proteína quinasa activada por mitógeno vía: ERK1/2 señalización. Actúa como una quinasa MAP 3, iniciando toda la cascada de la quinasa. Experimentos posteriores mostraron que los genes Raf normales, celulares también pueden mutar para convertirse en oncogenes, por "saturar" MEK1/2 y ERK1/2 actividad. De hecho, los genomas de vertebrados contienen múltiples genes Raf. Varios años más tarde después del descubrimiento de c-Raf, se describen otros dos quinasas relacionadas: A-Raf y B-Raf. El último se convirtió en el foco de la investigación en los últimos años, ya que una gran parte de los tumores humanos llevan mutaciones 'conductor' oncogénico en el gen B-Raf. Estas mutaciones inducen una incontrolada, alta actividad de las enzimas Raf. Interés tanto de diagnóstico y terapéuticos de quinasas Raf alcanzó un nuevo máximo en los últimos años.

Estructura

El gen c-Raf humano está localizado en el cromosoma 3. Al menos dos isoformas de mRNA se han descrito que ver sólo pequeñas diferencias. El más corto, isoforma principal - que consiste en 17 exones - codifica una proteína quinasa de 648 aminoácidos.

De manera similar a muchas otras quinasas MAP 3, c-Raf es una proteína multidominio, con varios dominios adicionales para ayudar a la regulación de su actividad catalítica. En su segmento N-terminal, un dominio de unión a Ras y un C-quinasa dominio homólogo 1 se encuentran uno junto al otro. Las estructuras de los dos dominios conservados se resolvieron en las últimas décadas, arrojando luz sobre los mecanismos de su regulación.

El dominio de unión a Ras muestra un pliegue ubiquitina y se une selectivamente sólo las proteínas Ras GTP.

El dominio C1 - inmediatamente aguas abajo del dominio de unión a Ras - es un dedo de zinc especial, rica en cisteínas y estabilizado por dos iones de zinc. Es similar a los dominios C1-diacilglicerol de unión de enzimas de la proteína quinasa C. Pero a diferencia de PKC, los dominios C1 de quinasas de la familia Raf no se unen diacilglicerol. En su lugar, interactúan con otros lípidos, tales como el ácido fosfatídico o ceramida, e incluso ayudar en el reconocimiento de Ras activados.

La estrecha proximidad de estos dos dominios, así como varias líneas de datos experimentales sugieren que actúan como una sola unidad para regular negativamente la actividad de la proteína quinasa de dominio, por interacción física directa. Históricamente, este bloque autoinhibitory fue etiquetado como la región CR1, la región bisagra de ser nombrado CR2, y el dominio quinasa CR3 - Desafortunadamente, la estructura precisa de la quinasa autoinhibited sigue siendo desconocido.

Entre el bloque autoinhibitory dominio y el dominio catalítico de la quinasa, un segmento largo - característica para todas las proteínas Raf - se puede encontrar. Es altamente enriquecido en aminoácidos serina, pero su secuencia precisa no está bien conservado a través de los genes relacionados con Raf. Esta región parece ser intrínsecamente no estructurada, y muy flexible. Su papel más probable es la de actuar como una "bisagra" natural entre los dominios catalítico y autoinhibitory rígidamente cruzados, lo que permite los movimientos complejos y profundos reordenamientos conformacionales dentro de la molécula. Esta región bisagra contiene un pequeño, isla conservada de aminoácidos, que son responsables del reconocimiento de proteínas 14-3-3, pero sólo cuando una serina crítico es fosforilada. Un segundo, motivo similar se encuentra en el extremo C-terminal de todas las enzimas Raf, pero aguas abajo de la quinasa de dominio.

La mitad C-terminal de pliegues c-Raf en un solo dominio de la proteína, responsable de la actividad catalítica. La estructura de este dominio quinasa es bien conocido tanto de c-Raf y B-Raf. Es muy similar a otras quinasas Raf y proteínas KSR, y claramente similar a algunos otros map3 quinasas, tales como la familia de quinasa de linaje mixto. Juntos comprenden la tirosina quinasa Como grupo de proteínas quinasas. Aunque algunas de las características unen sus dominios catalíticos con tirosina quinasas de proteínas, la actividad de TKLs se limita a la fosforilación de residuos de serina y treonina dentro de las proteínas diana. El sustrato más importante de quinasas Raf son los MKK1 y MKK2 quinasas, cuya actividad depende estrictamente de eventos de fosforilación realizadas por Rafs.

Relaciones evolutivas

Humano c-Raf es un miembro de una familia más grande de proteínas quinasas relacionadas. Otros dos miembros - que se encuentra en la mayoría de los vertebrados - pertenecen a la misma familia: B-Raf y A-Raf. Además de la diferente longitud de las no conservadas N-y C-terminal, todos comparten el mismo dominio de la arquitectura, la estructura y la regulación. En comparación con la conocida c-Raf relativamente y B-Raf, hay muy poco conocido de la función precisa de A-Raf, sino que también se piensa que es similar a los otros dos miembros de la familia. Todos estos genes se cree que son el producto del gen completo o duplicaciones del genoma en los albores de la evolución de los vertebrados, de un solo gen ancestral Raf. La mayoría de los otros organismos animales poseen un solo gen Raf. Se llama Phl o Draf en Drosophila y Lin-45 en C. elegans.

Los animales multicelulares también tienen un tipo de quinasa estrechamente relacionado con Raf: este es el supresor quinasa de Ras. Vertebrados como mamíferos tienen dos genes, KSR paralogous en lugar de uno: KSR1 y KSR2. Su dominio C-terminal quinasa es muy similar a Raf, pero la región reguladora N-terminal difiere. A pesar de que también tienen la bisagra flexible y un dominio C1 antes, KSRs carecen por completo el dominio de unión a Ras. En cambio, tienen regiones reguladoras únicas en sus extremos N-terminales, originalmente denominadas CA1 y CA2 - Durante mucho tiempo, la estructura del dominio CA1 era un misterio. Sin embargo, en 2012, la estructura de la región CA1 en KSR1 se resolvió: resultó ser un dominio SAM divergente, complementado con un enrollado de las bobinas: esto se supone para ayudar KSRs en unión a la membrana. KSRs, como Rafs, también tienen los dos motivos que asocian 14-3-3, pero también poseen nuevos motivos MAPK vinculante en sus regiones bisagra. Con una secuencia típica de Phe-X-Phe-Pro estos motivos son importantes para la regulación de la retroalimentación de las quinasas Raf en la vía ERK1/2. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, KSRs también participan en la misma vía como Raf, a pesar de que sólo desempeñan un papel auxiliar. Con una actividad de quinasa intrínseca muy pobre, que estaban mucho tiempo se pensó que sea inactivo, hasta que su actividad catalítica fue finalmente demostró en los últimos años. Pero incluso entonces, sólo aportan muy poco al MKK1 y MKK2 fosforilación. El papel principal de KSR parece ser la de proporcionar un socio heterodimerización a las enzimas Raf, lo que facilita en gran medida su activación por medio de allostery. Fenómenos similares se han descrito para otros map3 quinasas. ASK2, por ejemplo, es un pobre enzima en sí mismo, y la actividad parece estar ligado a ASK1/ASK2 heterodimerización.

Quinasas Raf-como son totalmente ausente de los hongos. Pero reciente secuenciación de otros opisthokonts reveló la presencia de auténticos quinasas Raf en eucariotas unicelulares. Por lo tanto es posible que las proteínas Raf son una herencia antigua y antepasados de los hongos secundariamente perdido señalización de Raf-dependiente. Hongos vías de MAP quinasas que son homólogas a la de mamíferos vía ERK1/2 son activados por MEKK en lugar de enzimas quinasas Raf relacionados.

Quinasas Raf encontrados en los retrovirus son secundariamente derivan de los genes de vertebrados correspondientes de sus anfitriones. Estos genes codifican proteínas Raf severamente truncadas, que carecen de todo el dominio N-terminal autoinhibitory, y los motivos de unión a 14-3-3. Tales truncamientos graves se sabe que inducen una actividad incontrolada de las quinasas Raf: que es exactamente lo que puede necesitar un virus para la reproducción eficiente.

Regulación de la actividad

Como se mencionó anteriormente, la regulación de la actividad de c-Raf es compleja. Como "guardián" de la vía ERK1/2, que se mantiene bajo control por una multitud de mecanismos inhibitorios, y normalmente no se puede activar en un solo paso. El mecanismo de regulación más importante consiste en la, asociación física directa del bloque autoinhibitory N-terminal para el dominio quinasa de c-Raf. Es el resultado de la oclusión del sitio catalítico y el apagado completo de la actividad quinasa. Este estado "cerrado" sólo puede ser aliviada si el dominio autoinhibitory de Raf se acopla a una pareja compitiendo con es propio dominio quinasa, lo más importante Ras GTP. Pequeñas proteínas G activadas pueden por lo tanto romper las interacciones intramolacular: esto se traduce en un cambio conformacional de c-Raf necesaria para la activación de la quinasa y la unión del sustrato.

14-3-3 proteínas también contribuyen a la autoinhibition. Como las proteínas 14-3-3 son conocidos para formar dímeros constitutivos, sus asambleas tienen dos sitios de unión. Así, el dímero actúa como un "manillas molecular", el bloqueo de sus parejas de unión a una distancia y orientación fija. Cuando los motivos de unión a 14-3-3 gemelas colocadas con precisión, son enganchados por un solo dímero proteína 14-3-3, se convierten en bloqueado en una conformación que promueve autoinhibition y no permite la separación de los dominios autoinhibitory y catalítica. Este "cierre" de c-Raf es controlado por motivo de fosforilación. Unphosphorylated motivos asocian 14-3-3 no se unen a sus parejas: que necesitan para fosforilados en serinas conservadas en primer lugar, por otras proteínas quinasas. La quinasa más importante implicado en este evento es TGF-beta activa quinasa 1, y las enzimas dedicados para la eliminación de estos fosfatos son la proteína fosfatasa 1 y complejos de proteína fosfatasa 2A.

Tenga en cuenta que la unión de 14-3-3 enzimas Raf no es necesariamente inhibitoria: una vez Raf está abierto y dimeriza, 14-3-3 también se puede unir en trans, puente entre dos quinasas y "esposas" al mismo tiempo a reforzar el dímero, en lugar de mantenerlos alejados el uno del otro. También existen más modos de interacción 14-3-3 con c-Raf, pero su función no es bien conocida.

La dimerización es otro mecanismo importante para la regulación de la actividad de c-Raf y requerido para la activación de Raf bucle de fosforilación. Normalmente, sólo los dominios quinasa "abiertas" participar en la dimerización. A diferencia de B-Raf, que forma homodímeros fácilmente consigo mismo, c-Raf prefiere heterodimerización con cualquiera de B-Raf o KSR1 - homodímeros y heterodímeros todos se comportan de manera similar. El homodímero de la estructura del dominio quinasa de B-Raf muestra claramente que los bucles de activación se colocan en una conformación activa-como en el dímero. Esto es debido a un efecto alostérico de la otra molécula de unión a la parte "posterior" de la quinasa; dichos dímeros son simétricas y tienen dos sitios catalíticos, parcialmente activos. En esta etapa, la actividad de las quinasas Raf es baja, e inestable.

Para lograr la plena actividad y estabilizar el estado activo, el bucle de activación de c-Raf necesita ser fosforilados. Los únicos quinasas conocidas actualmente para llevar a cabo este acto son los mismos quinasas de la familia Raf. Sin embargo, algunas otras quinasas, tales como PAK1 pueden fosforilar otros residuos cerca del dominio quinasa de c-Raf: la función precisa de estas quinasas auxiliares es desconocido. En el contexto de c-Raf, tanto c-Raf y KSR1 se necesitan para la etapa de "transfosforilación". Debido a la arquitectura de los dímeros, esta fosforilación sólo puede tener lugar en trans. Al interactuar con conservadas Arg y Lys residuos en el dominio quinasa, la activación fosforilada bucle conformación cambio y convertirse ordenado, cerrando definitivamente el dominio quinasa en un estado completamente activo hasta desfosforilado. La activación fosforilada bucles también hacen que la quinasa insensible a la presencia de su dominio autoinhibitory. KSRs no pueden someterse a este último paso, ya que faltan los residuos fosforilables en sus bucles de activación. Pero una vez que c-Raf se activa completamente, ya no hay necesidad de hacerlo: enzimas Raf activos pueden ahora involucrar a sus sustratos. Como la mayoría de las proteínas quinasas, c-Raf tiene múltiples sustratos. BAD se fosforila directamente por c-Raf, junto con varios tipos de guanilato ciclasa, la miosina fosfatasa, músculo cardiaco troponina T, etc La proteína retinoblastoma y fosfatasa Cdc25 también se sugirieron como posibles sustratos.

Los objetivos más importantes de todas las enzimas Raf son MKK1 y MKK2. Aunque la estructura del complejo enzima-sustrato c-Raf: MKK1 es desconocida, se puede modelar con precisión después de la KSR2: MKK1 complejo. Aquí hay catálisis real tiene lugar, pero se piensa que es altamente similar a la forma Raf se une a sus sustratos. La interfaz principal interacción es proporcionado por los lóbulos C terminales de los dos dominios de quinasa; la grande, desordenada rica en prolina bucle, única para MKK1 y MKK2 también juega un papel importante en su posicionamiento a Raf. Estos MKKs se vuelven fosforilados en al menos dos sitios en sus bucles de activación tras la unión a Raf: esto activará ellos también. Los objetivos de la cascada de la quinasa son ERK1 y ERK2, que se activan selectivamente por MKK1 MKK2 o - tienen numerosos sustratos de ERK en las células, sino que también son capaces de translocación en el núcleo para activar factores de transcripción nuclear. ERK activado son efectores pleiotrópicos de la fisiología celular y juegan un papel importante en el control de la expresión de genes involucrados en el ciclo de división celular, la migración celular, la inhibición de la apoptosis, y la diferenciación celular.

Enfermedades humanas asociadas

Ganancia de función de las mutaciones hereditarias de c-Raf están implicados en algunos síndromes raros, pero graves. La mayoría de estas mutaciones implican cambios de aminoácidos singe en uno de los dos motivos de unión a 14-3-3. La mutación de c-Raf es una de las posibles causas del síndrome de Noonan: los individuos afectados tienen defectos congénitos del corazón, baja estatura y dismórfico y otras deformidades. Mutaciones similares en c-Raf también pueden causar una afección relacionada, denominada síndrome del LEOPARDO, con una compleja asociación de defectos.

Papel en el cáncer

Aunque c-Raf es muy claramente capaz de mutar en un oncogén en parámetros experimentales, e incluso en algunos tumores humanos, su hermanos quinasa B-Raf es el verdadero jugador importante en la carcinogénesis en los seres humanos. Aproximadamente el 20% de todas las muestras de tumores humanos examinados mostrar un gen B-Raf mutada. La gran mayoría de estas mutaciones implican el intercambio de un solo aminoácido: Val 600 a Glu. Eso puede imitar el ciclo de fosforilación y activación - saltando todas las medidas de control en la activación normal de - provocarán el dominio quinasa en plena actividad. Puesto que B-Raf también puede activarse por homodimerización y c-Raf por heterodimerización, esta mutación tiene un efecto catastrófico girando la vía ERK1/2 constitutivamente activa, y la conducción de un proceso no controlado de la división celular.

Como un objetivo terapéutico

Debido a la importancia tanto de Ras y mutaciones de B-Raf en la tumorigénesis, se han desarrollado varios inhibidores de Raf para combatir el cáncer, especialmente contra B-Raf exhibiendo la mutación V600E. Sorafenib fue el primer agente clínicamente útil, que proporciona una alternativa farmacológica para tratar malignas previamente en gran parte intratables, como el carcinoma de células renales y el melanoma. Varias otras moléculas de seguimiento, tales como vemurafenib, Regorafenib, Dabrafenib, etc

Desafortunadamente, ATP-competitivo B-Raf-inhibidores puede tener un efecto no deseado en los cánceres K-Ras dependientes: son simplemente demasiado selectivo para B-Raf. Mientras que perfectamente bien inhiben la actividad de B-Raf en el caso de que un B-Raf mutante es el principal culpable, también promueven la homo-y heterodimerización de B-Raf, con ella misma y c-Raf. Esto en realidad mejorar la activación de c-Raf en lugar de inhibir que en caso de que haya ninguna mutación en los genes Raf, pero su proteína común aguas arriba activador de K-Ras es el mutado. Este "paradójica" la activación de c-Raf requiere la necesidad de la detección de mutaciones de B-Raf en los pacientes antes de iniciar una terapia de B-Raf-inhibidor.

Lista de las proteínas que interactúan

C-Raf se ha demostrado que interactúan con STUB1, como la proteína Retinoblastoma-2, CFLAR, CDC25A, proteína de retinoblastoma, YWHAQ, AKT1, BRAF, Bcl-2, PAK1, Prohibitin, MAP2K1, TSC22D3, HRAS, rheb, RAP1A, Src, proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1, proteína quinasa M?, GRB10, KRAS, MAPK7, proteína de choque térmico 90 kDa alfa, miembro de A1, ASK1, Fyn, BAG1, YWHAB, MAPK8IP3, YWHAZ, YWHAH, YWHAG, YWHAE, MAP3K1, RRAS2 y SHOC2.